最後更新於 2023 年 7 月 11 日
補充民國 110 年 3 月 18 日公告之衛授食字第 1101300380 號，L-5-甲基四氫葉酸鈣之檢測項目及計算方法，並加以描述水、鈣、葉酸、D-5-甲基葉酸、鉛、鎘、汞、砷含量檢測之標準溶液配製、系統適用性測試溶液配製、檢品溶液、移動相溶液調製、及儀器參數和測定法。
預告訂定「食品添加物規格檢驗方法－L-5-甲基四氫葉酸鈣」草案內容
分子式：C20H23CaN7O6 (無水型態)
分子量：497.5 (無水物)
1.含量
本品所含C20H23CaN7O6以無水物計，應為95.0～102.0%。
2.外觀
本品為白色至淺黃色，幾乎無味，結晶狀粉末。
3.鑑別
(1)溶解度：
本品微溶於水，微溶或不溶於大多數有機溶劑；可溶於鹼性溶液。
(2)紅外線吸收：
本品按照紅外線吸收光譜測定法(1)溴化鉀錠劑法(附錄A-29)測定之，其所測得之紅外線吸收光譜應與標準品相符。
(3)鈣：
取醋酸溶液(冰醋酸30 g加水使成100 mL) 5 mL，加入本品20 mg，再加入亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6]溶液(亞鐵氰化鉀5.3 g加水溶解使成100 mL) 0.5 mL，混合後加入氯化銨50 mg，形成白色結晶沉澱。
(4)液相層析：
本品依7. D-5-甲基葉酸進行液相層析之滯留時間應與L-5- 甲基四氫葉酸(L-5-methyltetrahydrofolate, L-5- MTHF)相符。
4.水
本品按照費氏水分測定法(附錄A-14)測定之，其水分含量應在17.0%以下。
註：於測定時允許足夠時間(15分鐘)釋放結合水。
5.鈣
取本品約250 mg，精確稱定，以去離子水150 mL溶解，加入氫氧化鈉試液(1N) 15 mL及羥基萘酚藍(hydroxy naphthol blue) 300 mg，混合均勻，用 0.05 M乙烯二胺四醋酸二鈉液滴定至液色呈深藍色為止，另作一空白試驗校正之，並以下列計算式求得檢品中鈣之含量(%)，其所含鈣(Ca)應在7.0～8.5% (無水物)。
檢品中鈣之含量(%) = [(VS – VB) × M × 40.08/W] × 100
VS：檢品溶液中0.05 M乙烯二胺四醋酸二鈉液之消耗量(mL)
VB：空白試驗中0.05 M乙烯二胺四醋酸二鈉液之消耗量(mL)
M：0.05 M乙烯二胺四醋酸二鈉液之實際莫耳濃度(mmol/mL)
W：檢品之採取量(mg)
6.其他葉酸及相關物質
依「12.含量測定」求得檢品中表內所列除D,L-5-甲基四氫葉酸 (D,L-5-MTHF)外各成分之波峰面積，並依下列計算式求出檢品中其他葉酸及相關物質之個別含量(Xi, %)，將所有 Xi 加總即得檢品中其他葉酸及相關物質之總含量，應在2.5%以下
Ai：檢品溶液中其他葉酸及相關物質之個別波峰面積
Ast：標準溶液中D,L-5-MTHF之波峰面積
Wst：D,L-5-MTHF-Ca標準品之稱重量(mg)
Ws：檢品之稱取量(mg)
Fi：第i物質之相對感應因子(如表內所示)
459.5：L-5-MTHF之分子量
497.5：L-5-MTHF-Ca之分子量
註：檢品中其他葉酸及相關物質之個別含量，以游離酸計。
7.D-5-甲基葉酸
以高效 液 相 層 析 法 測 定 檢 品 中 D-5- 甲 基 葉酸 (D-5- methyltetrahydrofolic acid, D-5-MTHF)之含量，應在1.0%以下。
(1)檢品溶液之調製：
取本品約50 mg，精確稱定，以去離子水定容至100 mL，供作檢品溶液。
(2)系統適用性測試溶液之配製
A標準溶液：
取D,L-5- 甲基四氫葉酸鈣(calcium D,L-5- methyltetrahydrofolate, D,L-5-MTHF-Ca)標準品(USP RS級) 50 mg，精確稱定，以去離子水溶解並定容至100 mL，供作標準溶液。
B系統適用性測試溶液：
取標準溶液1.0 mL，以(1)調製之檢品溶液定容至50 mL。
(3)移動相溶液之調製
取磷酸二氫鈉(NaH2PO4．2H2O) 4.68 g，以去離子水溶解使成1000 mL。取此溶液970 mL及乙腈(層析級) 30 mL，混合均勻，以32%氫氧化鈉溶液調整pH值至6.8，經濾膜過濾，供作移動相溶液。
(4)測定法：
精確量取檢品溶液及系統適用性測試溶液各10 µL，分別注入高效液相層析儀中，依下列條件進行分析。就檢品溶液所得D-5-MTHF及L-5-MTHF波峰之滯留時間與系統適用性測試溶液比較鑑別之，並依下列計算式求出檢品中D-5- MTHF之含量(%)：
AD：檢品溶液中D-5-MTHF之波峰面積
AL：檢品溶液中L-5-MTHF之波峰面積
高效液相層析條件：
紫外光或光二極體陣列檢出器：定量波長280 nm。
層析管：Chiral Protein HSA，5 µm，內徑4 mm X15 cm， 或同級品。
層析管溫度：40℃。注入量：10 µL。
移動相溶液：依(3)所調製之溶液。
移動相流速：1.0 mL/min。
註：
1. L-5-MTHF及D-5-MTHF之滯留時間約為11及15分鐘， 二者之解析度至少應為2以上。
2. 上述測定條件分析不適時，可依所使用之儀器，設定 適合之測定條件。
8.鉛
取本品0.5 g，按照衛生福利部公告「重金屬檢驗方法總則」進 行分析，其所含鉛( Pb )應在1 mg/kg以下。
9.鎘
取本品0.5 g，按照衛生福利部公告「重金屬檢驗方法總則」進 行分析，其所含鎘( Cd )應在0.5 mg/kg以下。
10.汞
取本品0.5 g，按照衛生福利部公告「重金屬檢驗方法總則」進 行分析，其所含汞( Hg )應在1.0 mg/kg以下。
11.砷
取本品0.5 g，按照衛生福利部公告「重金屬檢驗方法總則」進 行分析，其所含砷( As )應在1.5 mg/kg以下。
12.含量測定
以高效液相層析法測定檢品中L-5-甲基四氫葉酸鈣(calcium L-5-methyltetrahydrofolic acid, L-5-MTHF-Ca)之含量。
(1)標準溶液之配製
取 D,L-5- 甲 基 四 氫 葉 酸 鈣 (calcium D,L-5- methyltetrahydrofolate, D,L-5-MTHF-Ca)標準品(USP RS級) 約50 mg，精確稱定，以去離子水定容至100 mL，供作標準溶液。
(2)系統適用性測試溶液之配製
A.葉酸混合溶液：
分別取葉酸(folic acid, FA)標準品(USP RS 級)及4-aminobenzoylglutamic acid (ABGA)標準品(USP RS 級)各25 mg，精確稱定，加入碳酸氫鈉及碳酸鈉各約15 mg，再加入適量去離子水，超音波振盪溶解，以去離子水定容至100 mL。
B.系統適用性測試溶液：
取D,L-5-MTHF-Ca標準品(USP RS 級) 50.0 mg，置於100 mL容量瓶中，加入葉酸混合溶液1.0 mL，以去離子水溶解並定容至100 mL。
(3)檢品溶液之調製
取本品約50 mg，精確稱定，以去離子水定容至100 mL，供作檢品溶液。
(4)移動相溶液之調製
移動相溶液A：
取磷酸二氫鈉(NaH2PO4．2H2O) 7.80 g，溶於去離子水1000 mL，以32%氫氧化鈉溶液調整pH值至6.5，經濾膜過濾，供作移動相溶液A。
移動相溶液B：
取磷酸二氫鈉(NaH2PO4．2H2O) 5.07 g，溶於去離子水650 mL，加入甲醇(層析級) 350 mL， 混合均勻，以32%氫氧化鈉溶液調整pH值至8.0，經濾膜過濾，供作移動相溶液B。
(5)系統適用性測試
A.分析條件
精確量取系統適用性測試溶液及標準溶液各10 µL，分別注入液相層析儀中，依下列條件進行分析。系統適用性溶液中各成分波峰之參考滯留時間、相對滯留時間及相對感應因子如下表，其中L-5-MTHF及D-5-MTHF共沖提而呈單 一 波峰； 4α-hydroxy-5-methyltetrahydrofolic acid (HOMeTHFA)、5-methyltetrahydropteroic acid (MeTHPA) 及 dimethyltetrahydrofolic acid (DiMeTHFA) 為 D,L-5-MTHF- Ca 標準品所含之微量成分。
| 葉酸及相關物質 | 參考滯留時間(min) | 相對滯留時間 | 相對感應因子(F) |
| 4-Aminobenzoylglutamic acid (ABGA) | 4.4 | 0.29 | 0.91 |
| 4α-Hydroxy-5- methyltetrahydrofolic acid (HOMeTHFA) | 5.6 | 0.37 | 1.09 |
| (6R)-Mefox | – | 0.49 | 1.05 |
| (6S)-Mefox | – | 0.50 | 1.05 |
| Tetrahydrofolic acid (THFA) | – | 0.65 | 1.00 |
| 7,8-Dihydrofolic acid (DHFA) | – | 0.83 | 0.95 |
| Folic acid (FA) | 12.8 | 0.85 | 0.83 |
| 5,10-Methylenetetrahydrofolic acid (CH2THFA) | – | 0.88 | 1.00 |
| D,L-5-Methyltetrahydrofolic acid (D,L-5-MTHF) | 15.1 | 1.00 | 1.00 |
| 5-Methyltetrahydropteroic acid (MeTHPA) | – | 1.10 | 0.67 |
| Dimethyltetrahydrofolic acid (DiMeTHFA) | 18.8 | 1.25 | 1.00 |
B.適用性要求
(a) 系統適用性測試溶液中ABGA與HOMeTHFA之解析度(resolution)應為6以上。
(b) 系統適用性測試溶液中FA與MeTHPA之解析度應為8 以上。
(c) 系統適用性測試溶液中MeTHPA與DiMeTHFA之解析度應為15以上。
(d) 3個分別配製之標準溶液所得滯留時間之相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)應為2.0%以下。
(6)測定法
精確量取檢品溶液及標準溶液各10 μL，分別注入高效液相層析儀中，依下列條件進行分析。就檢品溶液所得主要波峰之滯留時間(約15.1 min)與標準溶液比較鑑別之，並依下列計算式求出檢品中L-5-MTHF-Ca之含量(%)。
As：檢品溶液中D,L-5-MTHF之波峰面積
Ast：標準溶液中D,L-5-MTHF之波峰面積
Wst：D,L-5-MTHF-Ca標準品之稱重量(mg)
Ws：檢品之稱取量(mg)
D：檢品中D-5-MTHF之含量(%)
M：檢品之水分含量(%)
高效液相層析條件：
紫外光或光二極體陣列檢出器：定量波長280 nm。
層析管：Purospher STAR RP-18e，5 µm，內徑4.6 mm x 25 cm或同級品。
層析管溫度：32℃。
注入量：10 µL。
移動相溶液：A液與B液以下列條件進行梯度分析
移動相流速：1.1 mL/min。
註：
1. 標準溶液及檢品溶液配製或調製完成後應立即分析， 且只能注入一次。
2.分析後，層析管以甲醇與去離子水(85:15, v/v)混合溶液沖洗及保存。
3.上述測定條件分析不適時，可依所使用之儀器，設定適合之測定條件。
參考文獻：
1.Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. 2006. Monograph 1. Calcium L-5-methyltetrahydrofolate. Compendium of Food Additive Specifications. [http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/jecfa_additives/docs/Monograph1/Additive-090.pdf]
2.United States Pharmacopeial Convention, Inc. 2015. Calcium L-5-methyltetrahydrofolate. Food Chemical Codex 9. pp. 203-207. United States Pharmacopeial Convention, Inc. Rockville, MD, USA.
資料來源：預告訂定「食品添加物規格檢驗方法－L-5-甲基四氫葉酸鈣」草案
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