預告訂定「食品添加物規格檢驗方法-L-5-甲基四氫葉酸鈣」草案

預告訂定「食品添加物規格檢驗方法-L-5-甲基四氫葉酸鈣」草案

最後更新於 2023 年 7 月 11 日

補充民國 110 年 3 月 18 日公告之衛授食字第 1101300380 號,L-5-甲基四氫葉酸鈣之檢測項目及計算方法,並加以描述水、鈣、葉酸、D-5-甲基葉酸、鉛、鎘、汞、砷含量檢測之標準溶液配製、系統適用性測試溶液配製、檢品溶液、移動相溶液調製、及儀器參數和測定法。

預告訂定「食品添加物規格檢驗方法-L-5-甲基四氫葉酸鈣」草案內容

預告訂定「食品添加物規格檢驗方法-L-5-甲基四氫葉酸鈣」草案。
L-5-甲基四氫葉酸鈣(L-5-Methyltetrahydrofolate calcium)

分子式:C20H23CaN7O6 (無水型態)

分子量:497.5 (無水物)

1.含量

本品所含C20H23CaN7O6以無水物計,應為95.0~102.0%。

2.外觀

本品為白色至淺黃色,幾乎無味,結晶狀粉末。

3.鑑別

(1)溶解度:

本品微溶於水,微溶或不溶於大多數有機溶劑;可溶於鹼性溶液。

(2)紅外線吸收:

本品按照紅外線吸收光譜測定法(1)溴化鉀錠劑法(附錄A-29)測定之,其所測得之紅外線吸收光譜應與標準品相符。

(3)鈣:

取醋酸溶液(冰醋酸30 g加水使成100 mL) 5 mL,加入本品20 mg,再加入亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6]溶液(亞鐵氰化鉀5.3 g加水溶解使成100 mL) 0.5 mL,混合後加入氯化銨50 mg,形成白色結晶沉澱。

(4)液相層析:

本品依7. D-5-甲基葉酸進行液相層析之滯留時間應與L-5- 甲基四氫葉酸(L-5-methyltetrahydrofolate, L-5- MTHF)相符。

4.水

本品按照費氏水分測定法(附錄A-14)測定之,其水分含量應在17.0%以下。

註:於測定時允許足夠時間(15分鐘)釋放結合水。

5.鈣

取本品約250 mg,精確稱定,以去離子水150 mL溶解,加入氫氧化鈉試液(1N) 15 mL及羥基萘酚藍(hydroxy naphthol blue) 300 mg,混合均勻,用 0.05 M乙烯二胺四醋酸二鈉液滴定至液色呈深藍色為止,另作一空白試驗校正之,並以下列計算式求得檢品中鈣之含量(%),其所含鈣(Ca)應在7.0~8.5% (無水物)。

檢品中鈣之含量(%) = [(VS – VB) × M × 40.08/W] × 100

VS:檢品溶液中0.05 M乙烯二胺四醋酸二鈉液之消耗量(mL) 

VB:空白試驗中0.05 M乙烯二胺四醋酸二鈉液之消耗量(mL) 

M:0.05 M乙烯二胺四醋酸二鈉液之實際莫耳濃度(mmol/mL)

W:檢品之採取量(mg)

6.其他葉酸及相關物質

依「12.含量測定」求得檢品中表內所列除D,L-5-甲基四氫葉酸 (D,L-5-MTHF)外各成分之波峰面積,並依下列計算式求出檢品中其他葉酸及相關物質之個別含量(Xi, %),將所有 Xi 加總即得檢品中其他葉酸及相關物質之總含量,應在2.5%以下

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葉酸及相關物質之個別含量計算

Ai:檢品溶液中其他葉酸及相關物質之個別波峰面積

Ast:標準溶液中D,L-5-MTHF之波峰面積

Wst:D,L-5-MTHF-Ca標準品之稱重量(mg)

Ws:檢品之稱取量(mg)

Fi:第i物質之相對感應因子(如表內所示)

459.5:L-5-MTHF之分子量

497.5:L-5-MTHF-Ca之分子量

註:檢品中其他葉酸及相關物質之個別含量,以游離酸計。

7.D-5-甲基葉酸

以高效 液 相 層 析 法 測 定 檢 品 中 D-5- 甲 基 葉酸 (D-5- methyltetrahydrofolic acid, D-5-MTHF)之含量,應在1.0%以下。

(1)檢品溶液之調製:

取本品約50 mg,精確稱定,以去離子水定容至100 mL,供作檢品溶液。

(2)系統適用性測試溶液之配製

A標準溶液:

取D,L-5- 甲基四氫葉酸鈣(calcium D,L-5- methyltetrahydrofolate, D,L-5-MTHF-Ca)標準品(USP RS級) 50 mg,精確稱定,以去離子水溶解並定容至100 mL,供作標準溶液。

B系統適用性測試溶液:

取標準溶液1.0 mL,以(1)調製之檢品溶液定容至50 mL。

(3)移動相溶液之調製

取磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O) 4.68 g,以去離子水溶解使成1000 mL。取此溶液970 mL及乙腈(層析級) 30 mL,混合均勻,以32%氫氧化鈉溶液調整pH值至6.8,經濾膜過濾,供作移動相溶液。

(4)測定法:

精確量取檢品溶液及系統適用性測試溶液各10 µL,分別注入高效液相層析儀中,依下列條件進行分析。就檢品溶液所得D-5-MTHF及L-5-MTHF波峰之滯留時間與系統適用性測試溶液比較鑑別之,並依下列計算式求出檢品中D-5- MTHF之含量(%):

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檢品中D-5- MTHF之含量

AD:檢品溶液中D-5-MTHF之波峰面積

AL:檢品溶液中L-5-MTHF之波峰面積

高效液相層析條件:

紫外光或光二極體陣列檢出器:定量波長280 nm。

層析管:Chiral Protein HSA,5 µm,內徑4 mm X15 cm, 或同級品。

層析管溫度:40℃。注入量:10 µL。

移動相溶液:依(3)所調製之溶液。

移動相流速:1.0 mL/min。

註:

1. L-5-MTHF及D-5-MTHF之滯留時間約為11及15分鐘, 二者之解析度至少應為2以上。

2. 上述測定條件分析不適時,可依所使用之儀器,設定 適合之測定條件。

8.鉛

取本品0.5 g,按照衛生福利部公告「重金屬檢驗方法總則」進 行分析,其所含鉛( Pb )應在1 mg/kg以下。

9.

取本品0.5 g,按照衛生福利部公告「重金屬檢驗方法總則」進 行分析,其所含鎘( Cd )應在0.5 mg/kg以下。

10.汞

取本品0.5 g,按照衛生福利部公告「重金屬檢驗方法總則」進 行分析,其所含汞( Hg )應在1.0 mg/kg以下。

11.砷

取本品0.5 g,按照衛生福利部公告「重金屬檢驗方法總則」進 行分析,其所含砷( As )應在1.5 mg/kg以下。

12.含量測定

以高效液相層析法測定檢品中L-5-甲基四氫葉酸鈣(calcium L-5-methyltetrahydrofolic acid, L-5-MTHF-Ca)之含量。

(1)標準溶液之配製

取 D,L-5- 甲 基 四 氫 葉 酸 鈣 (calcium D,L-5- methyltetrahydrofolate, D,L-5-MTHF-Ca)標準品(USP RS級) 約50 mg,精確稱定,以去離子水定容至100 mL,供作標準溶液。

(2)系統適用性測試溶液之配製

A.葉酸混合溶液:

分別取葉酸(folic acid, FA)標準品(USP RS 級)及4-aminobenzoylglutamic acid (ABGA)標準品(USP RS 級)各25 mg,精確稱定,加入碳酸氫鈉及碳酸鈉各約15 mg,再加入適量去離子水,超音波振盪溶解,以去離子水定容至100 mL。

B.系統適用性測試溶液:

取D,L-5-MTHF-Ca標準品(USP RS 級) 50.0 mg,置於100 mL容量瓶中,加入葉酸混合溶液1.0 mL,以去離子水溶解並定容至100 mL。

(3)檢品溶液之調製

取本品約50 mg,精確稱定,以去離子水定容至100 mL,供作檢品溶液。

(4)移動相溶液之調製

移動相溶液A:

取磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O) 7.80 g,溶於去離子水1000 mL,以32%氫氧化鈉溶液調整pH值至6.5,經濾膜過濾,供作移動相溶液A。

移動相溶液B:

取磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O) 5.07 g,溶於去離子水650 mL,加入甲醇(層析級) 350 mL, 混合均勻,以32%氫氧化鈉溶液調整pH值至8.0,經濾膜過濾,供作移動相溶液B。

(5)系統適用性測試

A.分析條件

精確量取系統適用性測試溶液及標準溶液各10 µL,分別注入液相層析儀中,依下列條件進行分析。系統適用性溶液中各成分波峰之參考滯留時間、相對滯留時間及相對感應因子如下表,其中L-5-MTHF及D-5-MTHF共沖提而呈單 一 波峰; 4α-hydroxy-5-methyltetrahydrofolic acid (HOMeTHFA)、5-methyltetrahydropteroic acid (MeTHPA) 及 dimethyltetrahydrofolic acid (DiMeTHFA) 為 D,L-5-MTHF- Ca 標準品所含之微量成分。

葉酸及相關物質參考滯留時間(min)相對滯留時間相對感應因子(F)
4-Aminobenzoylglutamic acid (ABGA)4.40.290.91
4α-Hydroxy-5- methyltetrahydrofolic acid (HOMeTHFA)5.60.371.09
(6R)-Mefox0.491.05
(6S)-Mefox0.501.05
Tetrahydrofolic acid (THFA)0.651.00
7,8-Dihydrofolic acid (DHFA)0.830.95
Folic acid (FA)12.80.850.83
5,10-Methylenetetrahydrofolic
acid (CH2THFA)
0.881.00
D,L-5-Methyltetrahydrofolic acid (D,L-5-MTHF)15.11.001.00
5-Methyltetrahydropteroic acid (MeTHPA)1.100.67
Dimethyltetrahydrofolic acid (DiMeTHFA)18.81.251.00
B.適用性要求

(a) 系統適用性測試溶液中ABGA與HOMeTHFA之解析度(resolution)應為6以上。

(b) 系統適用性測試溶液中FA與MeTHPA之解析度應為8 以上。

(c) 系統適用性測試溶液中MeTHPA與DiMeTHFA之解析度應為15以上。

(d) 3個分別配製之標準溶液所得滯留時間之相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)應為2.0%以下。

(6)測定法

精確量取檢品溶液及標準溶液各10 μL,分別注入高效液相層析儀中,依下列條件進行分析。就檢品溶液所得主要波峰之滯留時間(約15.1 min)與標準溶液比較鑑別之,並依下列計算式求出檢品中L-5-MTHF-Ca之含量(%)。

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檢品中L-5-MTHF-Ca之含量

As:檢品溶液中D,L-5-MTHF之波峰面積

Ast:標準溶液中D,L-5-MTHF之波峰面積

Wst:D,L-5-MTHF-Ca標準品之稱重量(mg)

Ws:檢品之稱取量(mg)

D:檢品中D-5-MTHF之含量(%)

M:檢品之水分含量(%)

高效液相層析條件:

紫外光或光二極體陣列檢出器:定量波長280 nm。

層析管:Purospher STAR RP-18e,5 µm,內徑4.6 mm x 25 cm或同級品。

層析管溫度:32℃。

注入量:10 µL。

移動相溶液:A液與B液以下列條件進行梯度分析

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移動相溶液梯度分析

移動相流速:1.1 mL/min。

註:

1. 標準溶液及檢品溶液配製或調製完成後應立即分析, 且只能注入一次。

2.分析後,層析管以甲醇與去離子水(85:15, v/v)混合溶液沖洗及保存。

3.上述測定條件分析不適時,可依所使用之儀器,設定適合之測定條件。

參考文獻:

1.Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. 2006. Monograph 1. Calcium L-5-methyltetrahydrofolate. Compendium of Food Additive Specifications. [http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/jecfa_additives/docs/Monograph1/Additive-090.pdf]

2.United States Pharmacopeial Convention, Inc. 2015. Calcium L-5-methyltetrahydrofolate. Food Chemical Codex 9. pp. 203-207. United States Pharmacopeial Convention, Inc. Rockville, MD, USA.

資料來源:預告訂定「食品添加物規格檢驗方法-L-5-甲基四氫葉酸鈣」草案

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